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2023-04-11 11:55
近日，承葛生物聯(lián)合山西省人民醫(yī)院、廈門聯(lián)合呼吸健康研究院、西安市中心醫(yī)院、福建中醫(yī)藥大學(xué)等三甲醫(yī)院與高校在腸道微生態(tài)領(lǐng)域頂級(jí)期刊《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》（IF: 6.073, JCR: Q1）發(fā)表活菌分析的研究性論文。文章以潰瘍性結(jié)腸炎（UC）為例，開創(chuàng)性的結(jié)合PMA和16s rRNA基因測(cè)序技術(shù)，建立了菌群中活菌數(shù)量與組成結(jié)構(gòu)的分析方法 （已獲授權(quán)發(fā)明專利，點(diǎn)擊查看）；進(jìn)一步通過(guò)菌群移植實(shí)驗(yàn)表明，只有移植活的腸道菌群才能顯著改善UC小鼠的表型、組織病理與腸道菌群結(jié)構(gòu)，揭示了高活性菌群在菌群移植中的重要性！文章還深入分析了UC小鼠失衡的活菌特征、以及與菌群移植治療帶來(lái)的小鼠癥狀改善密切相關(guān)的活菌種類等，為揭示腸道微生物及菌群移植與UC的發(fā)生發(fā)展和治療之間的重要關(guān)系提供了新視角和新證據(jù)。
期刊名稱：Frontiers in Cellular and Infection Microbiology
時(shí)間：2023年2月6日
影響因子：6.073 (JCR: Q1)
文獻(xiàn)簡(jiǎn)介
Shifts and importance of viable bacteria in treatment of DSS-induced ulcerative colitis mice with FMT
FMT治療DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠期間活的細(xì)菌群落的改變及其重要性
背景
潰瘍性結(jié)腸炎（UC）已成為全球公共衛(wèi)生問題，迫切需要新的治療方法。如今，腸道菌群移植（FMT）在治療UC的臨床試驗(yàn)與應(yīng)用中取得了顯著的成功，但它如何調(diào)節(jié)腸道微生物群以及改善疾病的機(jī)理急需進(jìn)一步闡述與揭示。
隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，宏基因組學(xué)（metagenomics）已經(jīng)成為研究微生物群落物種及功能的前沿科學(xué)，在腸道微生物、環(huán)境微生物等研究領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。在目前主流分析中，宏基因組學(xué)主要通過(guò)對(duì)微生物群落全部DNA進(jìn)行高通量測(cè)序，然而，這種分析方法往往忽略了活菌DNA的變化。此外，隨著研究的深入，在FMT中，活的微生物群被認(rèn)為發(fā)揮著主要的治療作用，因?yàn)檫@些微生物群能夠在受者腸道中的定植，從而導(dǎo)致受者腸道發(fā)生變化，達(dá)到治療的效果。因此，關(guān)注活的菌群對(duì)了解FMT的作用機(jī)制，探索關(guān)鍵的腸道菌群具有重要意義。
在本項(xiàng)研究中，我們開發(fā)了一項(xiàng)創(chuàng)新方法來(lái)評(píng)估UC小鼠模型以及FMT治療前后小鼠糞便中活的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的改變及其重要性。首先，基于小鼠的組織病理學(xué)和癥狀分析了FMT治療效果。同時(shí)，結(jié)合PMA處理與16S rRNA基因測(cè)序，分別分析FMT前和后活菌結(jié)構(gòu)變化，以及DSS和對(duì)照組之間活菌的差異。總之，該方法可準(zhǔn)確評(píng)價(jià)腸道微生物群中活菌的變化，更有效的幫助我們分析活菌數(shù)以及活菌組成，為微生態(tài)領(lǐng)域提供了研究活菌數(shù)量與組成的創(chuàng)新研究方法與策略。
研究結(jié)果
·高低活性菌群移植對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠療效觀察
為了研究FMT中活菌對(duì)結(jié)腸炎的緩解作用。我們通過(guò)給30只小鼠水中添加3%DSS，自由飲水連續(xù)5天，誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型。然后在第6天開始對(duì)小鼠進(jìn)行FMT干預(yù)，連續(xù)3天(圖1A)。對(duì)照組（CON）的小鼠（n=10）精神狀態(tài)良好，沒有腹瀉和軟便。DSS小鼠從造模第3天開始出現(xiàn)稀便，隨后出現(xiàn)嚴(yán)重的軟便、血便。DSS誘導(dǎo)的小鼠被平均分為三組，分別進(jìn)行FMT的高活性糞便、滅活糞便和生理鹽水治療。從圖1B中，我們可以看到前4天HF組（高活性糞便組）、IF組（滅活糞便組）和NF組（生理鹽水組）之間沒有明顯的差異，所有小鼠體重均呈下降趨勢(shì)。IF結(jié)腸長(zhǎng)度與CON組相比，結(jié)腸長(zhǎng)度明顯減少，而HF組、IF組和NF組之間沒有明顯的差異（圖1C）。DSS誘導(dǎo)的小鼠的DAI評(píng)分在第3天增加，其中HF組的小鼠在第3天的DAI評(píng)分明顯高于CON組，HF組的小鼠的DAI評(píng)分明顯低于NF組（圖1D）。在組織學(xué)評(píng)分方面，HF組的評(píng)分明顯低于IF和NF組，而IF組和NF組之間沒有顯著差異（圖1E）。同時(shí)，組織學(xué)分析進(jìn)一步揭示了觀察到的結(jié)腸標(biāo)本的組織病理學(xué)狀況如圖1F所示，CON組和HF組的結(jié)腸組織形態(tài)正常， 組織結(jié)構(gòu)層次分明，粘膜層、粘膜下層和肌肉層清晰可見，隱窩和杯狀細(xì)胞良好，排列整齊。而IF組和NF組看到不同數(shù)量的炎癥細(xì)胞，潰瘍病灶附近的隱窩擴(kuò)張?？傊@些結(jié)果表明，F(xiàn)MT中的活菌能夠參與并改善臨床上的結(jié)腸炎癥狀況和結(jié)腸損傷，而死菌則不能。
·DSS小鼠與正常小鼠之間的組織學(xué)和活的細(xì)菌群落差異 
組織學(xué)分析顯示，與正常小鼠相比，DSS誘導(dǎo)的小鼠在結(jié)腸粘膜層形成潰瘍病灶，壞死擴(kuò)散到整個(gè)粘膜，導(dǎo)致固有層脫落和結(jié)締組織增生，其間有不同數(shù)量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，潰瘍病灶附近的隱窩擴(kuò)張（圖3A）。另一方面，與CON組相比，UC小鼠糞便活細(xì)菌的α多樣性指數(shù)Observe、Shannon和J明顯下降（P<0.05，圖3C）。通過(guò)PCoA圖清楚地觀察到結(jié)腸炎小鼠和正常小鼠之間的活的細(xì)菌群落的聚類有顯著差異（P<0.05，圖3B）。此外，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的活細(xì)菌組成在屬的水平上與對(duì)照組存在明顯不同。與CON組相比，包括Massilia、Rikenella、Butyricoccus和Enterococcus在內(nèi)的16個(gè)屬中減少，而包括Akkermansia、Blautia和Odoribacter在內(nèi)的19個(gè)屬在DSS組顯著增加（P<0.05，圖3D）。這些結(jié)果表明，DSS誘導(dǎo)后顯著改變了小鼠的腸道中活的細(xì)菌群落和結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)。
·FMT對(duì)腸道活的細(xì)菌群落的影響
通過(guò)16S rRNA基因高通量測(cè)序分析了HF、NF和IF組的腸道微生物群的變化。HF組的豐富度指數(shù)顯著低于IF和NF組，但Shannon和J指數(shù)沒有明顯差異（圖4A）；PCoA圖分析顯示，治療后三組的活的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在著顯著差異（P<0.05，圖4B）。利用SPEC-OCCU對(duì)HF、IF和NF組的微生物群進(jìn)行特異性和占有率（≥0.7）分析（圖4C），共鑒定到與HF組密切相關(guān)的五個(gè)特定的屬，即Bacteroides、Lactobacillus、Halomonas、Bifidobacterium和Fusobacterium。Fusobacterium的相對(duì)豐度在IF組顯著高于NF組（P<0.05），而HF組與其他兩組沒有明顯差異。然而，HF組的Halomonas和Lactobacillus的相對(duì)豐度明顯高于IF組（圖4D）。在FMT前和后對(duì)比分析中，也觀察到Bacteroides、Lactobacillus、Halomonas、Bifidobacterium和Fusobacterium的相類似的變化趨勢(shì)。本次研究鑒定出多個(gè)發(fā)生顯著改變的活細(xì)菌屬，他們對(duì)UC的癥狀的改善可能起著核心作用，這可能對(duì)UC的診斷和治療具有潛在的意義，值得進(jìn)一步深入探索。
總結(jié)語(yǔ)
菌群移植的臨床試驗(yàn)正在全球范圍內(nèi)快速推進(jìn)，其臨床適應(yīng)癥也在不斷拓展與擴(kuò)大，臨床價(jià)值與市場(chǎng)空間巨大、前景廣闊。本研究開創(chuàng)性的結(jié)合PMA和16s rRNA基因高通測(cè)序技術(shù)，建立了分析菌群中活菌數(shù)量與組成結(jié)構(gòu)的新方法；結(jié)合菌群移植實(shí)驗(yàn)，證明了高活性菌群在菌群移植中的重要性！通過(guò)分析UC小鼠失衡的活菌特征、以及與菌群移植治療帶來(lái)的小鼠癥狀改善密切相關(guān)的活菌種類等，為揭示腸道微生物及菌群移植與UC的發(fā)生發(fā)展和治療之間的重要關(guān)系提供了新視角和新證據(jù)。本研究所建立的方法，還可用于菌群移植治療消化、代謝、腫瘤等各系統(tǒng)疾病的微生態(tài)（活菌數(shù)量與群落結(jié)構(gòu)）相關(guān)研究。
